靶向治疗诱导耐药
Nature. Authormanuscript; available in PMC 2015 Oct 16.Published in final edited form as:
Nature.2015 Apr 16; 520(7547): 368–372.
Published online 2015 Mar25. doi:10.1038/nature14336
Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumourprogression
标题:治疗诱导的肿瘤分泌蛋白促进肿瘤耐药和进展
摘要:
药物耐药性不可避免地限制针对癌症患者靶向治疗的临床疗效 。这里我们展示对BRAF，ALK，或EGFR激酶抑制剂的靶向治疗在药物压力的黑色素瘤和肺腺癌细胞中诱发了一个复杂的分泌信号网络。这种由治疗引起的分泌蛋白(TIS)刺激了耐药癌细胞克隆的过度生长、传播和转移，并支持药物敏感的癌细胞存活，导致肿瘤的不完全退化。在黑色素瘤中，威罗非尼反应性分泌蛋白是由下游转录因子FRA1调控所驱动。在原位转录组分析耐药黑素瘤细胞对退化肿瘤微环境的应答揭示了多重信号通路的超活化，最主要的是AKT通路。RAF和PI3K/AKT/mTOR通路双重抑制抑制了BRAF突变黑色素瘤肿瘤中耐药细胞的过度生长，表明这种联合治疗是对抗肿瘤复发的一种策略。因此，对癌基因驱动的治疗抑制诱导了对药物敏感的癌细胞巨大的分泌变化，自相矛盾的是建立了一个肿瘤微环境来支持耐药性克隆的扩展，但是却容易受到联合治疗的影响。
正文:
如威罗非尼、厄洛替尼或克唑替尼等激酶抑制剂已经在BRAF突变的黑素瘤，或者在有EGFR突变或ALK转位的肺腺癌显示了临床疗效。虽然完全应答罕见，但绝大多数患者都表现出部分肿瘤退化或疾病稳定。然而，药物耐药性总是不断进展，大多数患者在6个月到12个月的时间内取得进展，这表示靶向治疗的常见并发症影响长期治疗成功。临床药物耐药的迅速出现可能是由少量预先存在的癌症细胞促成的，这些细胞具有内在的耐药力，或准备迅速适应药物治疗。这些少数耐药细胞是如何在肿瘤退化中对微环境的剧烈变化作出反应的，目前尚不清楚。对这一过程的更好理解可能会提高目前靶向抗癌药物的疗效。
为了体内建模异构肿瘤细胞的靶向治疗,我们混合了一小部分威罗非尼耐药的A375人黑色素瘤细胞(A375R),用TK-GFP-Luciferase拟似物标记(TGL),加上大多数无标记, 威罗非尼敏感A375细胞,小鼠皮下注射混合细胞(A375 / A375R,99.95 / 0.05%)。在肿瘤建立后，我们用威罗非尼或拟似物对小鼠进行了治疗，并通过生物荧光成像(BLI)在体内监测耐药细胞的生长。虽然威罗非尼治疗减少了敏感肿瘤的体积(只A375细胞)，但是与拟似物治疗的对照相比(A375/A375R)，退化肿瘤的耐药细胞数量明细增加。GFP染色证实退化肿瘤耐药细胞的数量增加,和EdU 或BrdU染色证实了增加耐药细胞增殖率与拟似物相比。只有耐药细胞组成的肿瘤没有表现出生长差异当使用拟似物或威罗非尼时,表明退化肿瘤耐药细胞的生长优势并非由于威罗非尼对癌症或基质细胞的直接作用引起的。
用达拉非尼治疗混合A375 / A375R肿瘤,另一个BRAF抑制剂(RAFi),或强力酶素诱导的BRAF敲除有类似的效果。与这些发现一致,A375R细胞与其他威罗非尼敏感黑色素瘤细胞系一起植入(Colo800、LOX和UACC62)也显示8倍的生长增长相比拟似物治疗对照组。在病人衍生的黑色素瘤细胞系M249和它的威罗非尼耐药性衍生物M249R4中也观察到耐药肿瘤细胞的生长加速，由NRAS突变驱动,是一种临床相关的耐药机制。在免疫活性的老鼠,威罗非尼治疗的衍生于BRAFV600E/CDKN2A/ /PTEN / mice (YUMM1.1, YUMM1.7)黑色素瘤细胞系也促进混合威罗非尼耐药细胞的生长(YUMM 1.7R, B16)。
克唑替尼或埃罗替尼治疗小鼠肿瘤分别是ALK驱动(H3122)或EGFR驱动(HCC827)人类肺腺癌细胞,可见混有少数天生耐药的克隆细胞来自同一细胞谱系(肺腺癌细胞H2030 PC9)或黑素瘤细胞(A375R)也导致增加耐药细胞过度生长。退化皮下肿瘤的耐药细胞局部加速生长导致更高的肺转移负荷。因此，耐药的癌细胞受益于周围药物治疗敏感的细胞。
循环肿瘤细胞(CTCs )可以渗透并殖民肿瘤。这种现象被称为“自我播种”，可能有助于将耐药的克隆体分布到多个转移位点。植入了敏感的A375肿瘤的小鼠接受了拟似物或威罗非尼治疗，并在心内注射了TGL标记的A375R细胞。A375R细胞对威罗非尼治疗的退化肿瘤细胞更有吸引力与拟似物治疗参照相比,分别是95%(21/22)和12.5%(2/16), 显示退化肿瘤的耐药肿瘤细胞大量积累。为了评估耐药肿瘤播种对疾病复发的影响，我们在肿瘤细胞内注射耐药A375R细胞或拟似物，并比较威罗非尼治疗期间的肿瘤体积。对照组中未被播种的肿瘤显示出广泛的肿瘤退化，由A375R细胞播种导致快速肿瘤复发。这些结果表明，靶向治疗退化的肿瘤更能吸引耐药CTCs，可能会有助于肿瘤的快速进展。
肿瘤由一个由免疫、基质和癌症细胞组成的复杂的微环境。这种微环境中的可溶性介质可以促进肿瘤生长和治疗抵抗。考虑到药物敏感的癌症细胞是受靶向治疗影响的主要细胞，我们假设从敏感的癌细胞中获得的应答激酶抑制剂信号驱动耐药细胞的过度生长。为了验证这一假设，我们建立了一个体外培养系统，并在缺乏或存在敏感细胞情况下，使用激酶抑制剂或拟似物治疗,并监测了TGL表达的耐药细胞(A375R，H2030)生长情况。类似我们体内的发现，用威罗非尼,克唑替尼治疗的敏感细胞的联合培养能明显增强耐药肿瘤细胞的生长。
我们从威罗非尼敏感黑色素瘤细胞中派生处理过的介质(CM)培养缺乏威罗非尼(CM-载体)或存在威罗非尼(CM-威罗非尼)。CM-威罗非尼加速耐药细胞的增殖,使用不同的临床相关的耐药机制,经细胞生存能力和Ki67染色分析。同样,来自克唑替尼治疗或厄洛替尼治疗敏感的肺腺癌细胞CM刺激肺腺癌扩散,通过内在或获得性方式耐药,跨不同的细胞谱系。此外, 在trans-well迁移和单层gap-closing化验,CM-威罗非尼引起细胞迁移增加。CM-威罗非尼也在威罗非尼敏感癌细胞有活性,在体外威罗非尼治疗这些细胞,提高生存和抑制促细胞凋亡caspase 活性高达100倍。因为所有生物活性CM是细胞死亡或衰老之前获取,很可能分泌蛋白积极产生是致癌基因抑制的结果。这些结果说明BRAF、ALK和EGFR突变细胞靶向治疗下应对治疗压力分泌因子促进药物敏感细胞的生存和加速少数耐药克隆的生长。这种反应性分泌可能会扩大先前报道的耐药性机制，包括对细胞内信号的反馈抑制减轻、受体酪氨酸激酶的上调，以及基质细胞的补给以保护药物敏感细胞。
为了确定反应性分泌蛋白的相关成分和调控因子，我们在体外分析了敏感的A375黑素瘤细胞在暴露于威罗非尼的不同时间点的基因表达变化。在6小时后，473个基因显示表达改变和通路分析显示这些基因富含转录调节因子，在48小时后，超过1/3的转录组存在不同的表达(超过5000个基因; 405个基因编码蛋白在细胞外区域GO:0005576), 明显与体内的A375肿瘤的基因表达发生重叠在威罗非尼治疗5天后。在使用威罗非尼治疗的Colo800和UACC62黑素瘤细胞，以及使用克唑替尼治疗肺腺癌H3122细胞观察到类似的广泛的基因表达变化。尽管不同的细胞谱系, 不同的致癌驱动和不同的靶向治疗,我们观察到黑色素瘤和肺腺癌细胞分泌蛋白的重叠(p < 9.11E-5)。此外, 威罗非尼敏感黑色素瘤细胞分泌蛋白的变化与免疫细胞成分的变化一致,与来源于小鼠基质细胞的可溶性介质变化一致，如IGF1和HGF。这些数据表明治疗诱导分泌(TIS)是一种应答，由许多上游和下游分泌因子组成,渗透到退化肿瘤微环境和刺激癌细胞,也可能刺激基质细胞。
为确定A375-TIS分子驱动基因应答于威罗非尼,我们整合在威罗非尼治疗6 小时后转录因子表达的数据差异，与48小时后不同表达的分泌基因的启动子基序绑定大量转录因子。本分析强调FRA1(FOSL1)，一个AP1转录因子复合体的成员和ERK 通路效应子,作为一个推定的上游TIS的调控因子。对威罗非尼, 克唑替尼和埃罗替尼治疗的所有药物敏感细胞，FRA1都下调,除了耐药细胞。黑色素瘤患者RAFi治疗开始前面时间的活检证实威罗非尼诱导FRA1下调在临床样本中。
为了测试FRA1调节TIS的功能角色,我们使用了RNAi来抑制FRA1表达。联合培养和条件媒介试验，使用A375-shFRA1细胞用威罗非尼治疗显示了类似的生长加速和趋化活性，与A375细胞威罗非尼治疗结果一致，A375细胞敲除FRA1诱导转录变化类似于威罗非尼所引起的变化。A375R细胞与A375-shFRA1或UACC62-shFRA1细胞一同植入也显示体内的生长增加。与表达控制拟似物的肿瘤相比，A375-shFRA1肿瘤从血液循环中吸引了更多的抗肿瘤细胞。因此，FRA1下调驱动威罗非尼治疗的肿瘤细胞促肿瘤分泌的诱导。
为了确定反应性分泌对耐药肿瘤细胞的作用，我们在A375R细胞中表达与绿色荧光蛋白(egfp-rpl10a)混合的核糖体蛋白L10a，通过对随后的RNAseq分析的多核糖体免疫反应，对其进行特异性的检索。与体内加速生长的表型一致，在退化微环境中的耐药细胞基因表达模式在细胞存活、增殖和细胞移动过程中被强化。对表达数据的通路分析提示包括PI3K/AKT, BMP-SMAD和NFkB几种通路激活。在这种情况下，PI3K/AKT通路的过度激活也表明了细胞对PI3K/mTOR抑制剂的潜在脆弱性。PI3K / AKT通路分析预测的激活也反映在蛋白质水平，包括耐药和敏感细胞存在CM-威罗非尼体外和体内治疗。此外, 体外靶向免疫印迹分析生存通路，PI3K / AKT成为主导TIS应答通路。
TIS包含许多介质直接或间接激活AKT通路。正调节因子包括IGF1、EGF、ANGPTL7和PDGFD，在治疗过程中被上调，其中任何一个体外都激活了的AKT通路。IGF1是AKT途径最有效的激活基因之一，在肿瘤基质中也有丰富表达，在靶向治疗中进一步受到上调。此外,IGFBP-3水平,一个IGF1负调节因子,在所有调查的细胞系TIS明显降低, 在IGF1存在情况下有利于促进AKT通路激活和刺激体内耐药细胞的增殖。
为测试AKT激活作为TIS诱导的肿瘤增殖一个调控基因,我们联合威罗非尼和AKT/PI3K/mTOR抑制剂。在使用CM的联合培养和增殖试验中，对MAPK和AKT通路的双重抑制降低了TIS的生长获益。然后我们用威罗非尼和AKT(MK2206)或PI3K/mTOR(BEZ235)抑制剂对小鼠进行了治疗。联合抑制MAPK和PI3K/AKT/mTOR 通路大大减弱了威罗非尼耐药性A375/A375R细胞的过度生长。生长抑制是特定于在退化的肿瘤微环境中扩充增殖，对耐药细胞的生长没有影响。此外，在肿瘤播种试验，当退化肿瘤与BEZ235联合治疗的情况下，耐药肿瘤A375R细胞的过度生长速度明显降低。因此，TIS诱导的增殖对靶向治疗较敏感。
靶向治疗效果有限，其原因是细胞内的反馈回路和特定的细胞因子，这些支持药物敏感细胞的存活。从这些残留的肿瘤中，克隆出来的是对靶向治疗具有内在抵抗性，并且最终导致临床复发。我们的研究表明，靶向抑制癌症驱动通路，可以通过诱导复杂的、反应性分泌诱导，来促进这互相矛盾两个的方面：促癌或抑癌。这种由治疗引起的分泌（TIS）不仅能增强药物敏感细胞的生存，而且能加速耐药性克隆的扩展和传播。TIS不是一种细胞死亡副产品，而是一种活细胞的反应，应答于癌症通路抑制，通过一个具体转录程序来调节，并由细胞内信号网络的特定改变来定义。
我们对AKT信号的识别是BRAF驱动的黑素瘤AKT调节TIS诱导的肿瘤进展，与临床威罗非尼治疗肿瘤AKT激活相一致。使用BRAF抑制剂治疗的患者很少出现完全的肿瘤退化，而其余的药物应答肿瘤细胞在治疗期间可能仍然是TIS来源。我们的研究结果提供了PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂与MAPK通路抑制剂联合治疗的理论依据。然而，在不同的细胞谱系、药物(威罗非尼、克唑替尼和埃罗替尼)中，我们发现的TIS广度和普遍性，以及耐药性机制表明，持久的反应可能需要这类药物的联合。
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手挽手 发表于 2017-10-30 22:05 static/image/common/back.gif
先收藏，看不懂啊
谢谢分享
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