免疫组化---信息收集

http://oncol.dxy.cn/article/63605?trace=drugs
有效识别 ALK 蛋白表达 实现肺癌患者个体化治疗

肺癌是全球排名第一位的肿瘤杀手。与 30 年前相比，我国肺癌死亡率上升了 465%[1]，发病率高居榜首。肺癌通常分为非小细胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。其中 NSCLC 占了肺癌的 85%。

随着肿瘤分子生物学的进展，临床上对 NSCLC 的认识正不断深入。研究表明，50% NSCLC 的发生是由于一系列的驱动基因，包括 EGFR，KRAS，ALK，MEK，PI3K，BRAF 等。找到驱动基因，再进行针对性用药，NSCLC 治疗就能事半功倍。研究人员发现，胰岛素受体家族的成员——间变性淋巴瘤激酶（ALK）是 NSCLC 的关键启动癌基因。在 NSCLC 患者中，虽然只有 5%[2] [3] [4] 的患者会出现 ALK 基因重排，但是中国每年新发病例数仍接近 35,000 例 [5]。由于 ALK 阳性 NSCLC 具有明确的分子靶点、靶点检测技术以及上市的靶向药物，通过准确诊断 ALK 基因重排， ALK 阳性患者可从酪氨酸激酶抑制剂（克唑替尼）治疗中获益，明显提高临床疗效。

从组织学分型上，还有肺腺癌和肺鳞癌之分。由美国病理协会、国际肺癌研究协会、分子病理协会出台的《肺癌分子标志物检测指南 2013》明确指出：所有含有腺癌成分的 NSCLC 均需检测 ALK。今年 6 月，由中国临床肿瘤学会肿瘤生物标志物专家委员会出台的《中国间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性非小细胞肺癌诊断专家共识（2013 版）》（简称《共识》）指出：对于潜在怀疑存在 ALK 基因融合变异的患者均可进行 ALK 融合基因检测。

在第七届中国病理医师年会期间，罗氏诊断举办了“ALK 在 NSCLC 中的诊断与经验分享”卫星会，全国知名病理专家就 ALK 检测方法、最新标准化的 ALK 免疫组化检测判读指南等内容进行了探讨。

ALK 融合基因的检测方法

根据《共识》，荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）、基于 PCR 扩增基础上的技术和免疫组织化学法（immunohistochemistry, IHC）均可作为针对 ALK 融合基因检测常用的方法，实验室可以根据组织标本类型选择合适的检测技术。

由于大部分克唑替尼治疗 ALK 阳性 NSCLC 的临床试验均是基于 FISH 的诊断，因此，FISH 检测目前仍是确定 ALK 融合基因的参考标准方法。但是，由于 FISH 检测对于操作和判读技术的要求很高，只有 FISH 操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性；而且晚期 NSCLC 患者通常只能提供 2mm 左右的小活检组织，因此很难保证每个视野存在 50 个以上的癌细胞供结果判读；而且暗视野下无法获得完整的组织形态学结构。FISH 检测结果要求≥15% 的判断界值（cut off）也存在商榷之处，研究结果显示少数 ALK FISH 检测阴性、IHC 检测阳性的患者也能从靶向药物中获益。同时，目前 FISH 检测的成本昂贵，且不能明确 ALK 融合基因的具体融合变体。因此，在现阶段，FISH 检测尚无法适用于中国 ALK 阳性 NSCLC 患者的大规模筛查和诊断。

基于 PCR 扩增基础上的 RT-PCR 法检测 ALK 融合基因的特点在于快速、简便易行，能同时明确 ALK 基因已知的融合变体的类型。但是，该方法对于 RNA 提取的质量要求较高，国内部分实验室未具备严格的质量控制条件。此外，无法检测未知的融合型是其最大的不足之处，限制了其在 ALK 诊断中的应用。

早期的 ALK 融合蛋白的 IHC 抗体敏感性较低，因此不适宜用于 ALK 融合蛋白的检测。随着技术的改进， 罗氏诊断 VENTANA ALK IHC 检测特异性的提高了检测灵敏度，同时采用全自动化操作，使检验流程和结果判读都得以标准化，可实现与 FISH 结果高度一致性，结果判读的可重复性为 99.7%，为 ALK 检测的临床广泛应用带来了巨大的突破。

图 1：ALK 检测方法比较

首款全自动 IHC 检测获认可

VENTANA ALK IHC 检测是唯一获得欧盟认证的用于识别适合克唑替尼治疗的患者的体外诊断 IHC 检测，已在全球超过 53 个国家销售。日前，该检测获得了中国国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准在华上市。该项批准基于一项囊括了北京肿瘤医院、中国医学科学院肿瘤医院、复旦大学附属肿瘤医院的 1,100 个中国患者的回顾性研究，证明了 VENTANA ALK IHC 检测与雅培 Vysis ALK Break Apart FISH 探针试剂盒的一致性达 99.23%。

VENTANA ALK IHC 技术平台方法使用了基于非内源性半抗原、信号扩增多聚体和辣根过氧化物酶系统的染色信号放大技术。在不影响检测特异性的前提下，提高了敏感性。结果判读时采用二分类系统，即仅为阳性和阴性两种，阳性结果即可诊断为 ALK 阳性 NSCLC。

来自复旦大学附属肿瘤医院的免疫组化病例证实，VENTANA ALK IHC 检测具有独特优势。判读标准简单；敏感性高，均为强阳性颗粒，不用判断强度和百分比；全自动检测有效避免操作流程中的误差，可重复性好；可检测 FFPE 的细胞学样本、细针穿刺、支气管活检以及大体样品, 没有最低细胞数要求。最重要的是，价格便宜，可同时用于 ALK 的筛选和诊断。

在进行 VENTANA ALK IHC 检测时，建议检测人员使用 10% 的中性福尔马林和锌福尔马林固定后，用石蜡包埋组织样品，时间应不少于 6 小时，但不要超过 24 个小时；为了避免严重影响染色结果，应避免使用 AFA、B5、Bouin’s 或 95% 酒精固定。建议使用保存不超过 3 个月、厚度约为 4 微米的切片，使用正电荷载玻片。

ALK 阳性 NSCLC 诊断流程

鉴于 ALK 基因重排或融合的分子诊断各种方法均有优缺点，且我国适用于 ALK 变异检测的肺癌患者人数众多，《共识》中提出一套行之有效的分子诊断流程（见图 3），并认为 IHC 具有方便、易行、价格低的优势，适合于 ALK 阳性 NSCLC 的筛查。FISH 和 RT-PCR 由于结果判读客观，且 qRT-PCR 已获 CFDA 批准用于临床检测，适合于最终的确诊。

《共识》专家组推荐 ALK 基因状态检测的总体原则：应综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子检测方法的特点、实验室自身条件，进行多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，以保证 ALK 阳性肺癌的检出率和准确率。

图 3：中国 ALK 阳性 NSCLC 患者诊断流程图

注：（1）a：建议优先在以下临床病理特征集中的患者标本中进行筛选：粘液型腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄 <60 岁，但这些特征并非排他性的，即对其他疑有 ALK 融合变异患者均可进行检测；（2）b：对于部分无条件行 VENTANA IHC 检测的医疗机构或中心，常规 ALK IHC 可作为替代筛选方法，但阳性标本需以 FISH、VENTANA IHC 或序列特异性的 PCR 技术进一步确诊（3）ALK 抗体使用推荐：VENTANA IHC 使用专用抗体试剂盒（D5F3）；（4）流程图中 FISH、RT-PCR、VENTANA IHC 技术之间的虚线表示：单一技术检测结果判断不确定时 3 种方法之间可相互验证结果；（5）c：序列特异性的 PCR 技术诊断 ALK 融合基因条件：PCR 产物经测序后序列比对确认或基于特异性荧光探针的即时定量 PCR 检测融合变异，单纯 RT-PCR 产物经电泳后的条带观察不推荐作为 ALK 融合基因诊断依据；（6）请参考 2013 年度美国病理学家学会（CAP）、国际肺癌研究协会（IASLC）、分子病理学协会（AMP）联合发布的《肺癌患者使用靶向药物的分子检测指南》[6]

NSCLC 的分子靶向治疗将越来越依赖于分子靶点变异的分子诊断。临床实践中分子检测的标准化和标准流程的建立对于“提高临床实践能力”起到关键作用。ALK 基因融合变异作为晚期肺癌中的第二个明确应用的分子分型，其诊断方法和流程仍需进一步结合临床数据进行优化。

检测PI3K信号通路的激活程度，一般都是western Blot或者免疫组化的方法，检测anti-pAkt（Ser473）或者anti-pAkt （Thr308），这两个磷酸化位点都行，都能说明问题，你要是经费充足的话，可以两个都做。
至于你说的“还有，需要anti-Akt进行对照 吗？”，怎么还进行对照？是这样：Akt磷酸化以后才有活性，所以你要是经费有限，可以只检测pAkt的水平，这样也能说明问题，也能发文章。但是要是想 把实验做得完善的话，还是应该加上Akt的总体蛋白水平。大部分文章还是把总蛋白和磷酸化蛋白都来检测的，这样比较完善。

免疫组化（immunohistochemistry, IHC）方法检测：EGFR、pEGFR、PI3K及AKT蛋白与肺癌的发生发展密切相关，EGFR与pEGFR无明显相关性，且PI3K/AKT通路的激活可能与EGFR活化无明显相关性。

实时荧光定量PCR检测肺癌干细胞中AKTl和PI3K P85mRNA的表达。

http://iwww.yuaigongwu.com/forum ... &extra=page%3D1
基因检测技术介绍  brookzhan

http://iwww.yuaigongwu.com/forum ... page%3D1&page=2
WZ4002联合一代抑制剂无效的想法  晃晃

一般免疫组化是根据+号数目来判断阳性和阴性的，3个+是判断为阳性，一个+是判断为阴性，2个+是需要进一步检查，使用FISH等。对于后面的百分数，我查了下，HER2的是30%表明视野下，30%的细胞呈现强着色，即归结为阳性，如果10%则表明10%的细胞表明强着色，归结为阴性，10-30%之间就是不可判断为阴性或者阳性，需要进一步检查了。您的检测结果Her2是一个+，应该是阴性。VEGF数据在30%，即阴性和阳性之间，算是可以勉强归结为阳性，可能弄了个加减号，而EGFR表达很高，50%的比例，远大于30%，所以给出了+的判断。以上的这些请参考

可以这样理解，如P53是个抑癌基因，它突变会导致癌症的发生，但不是所有肿瘤都有这个基因突变，对于这种使用+表示突变阳性，-表示突变阴性。而对于HER2等，只是在表达量有差异的蛋白，则低表达，一个+归结为阴性，3个+表示阳性，它们不存在完全不表达的情况

http://www.caca.org.cn/system/2009/07/16/010025268.shtml
HC、FISH和CISH 基本检测方法各擅所长

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健康医生对MASCT自体免疫细胞治疗技术p53基因的解读
2014年07月18日 10:58
      p53基因为MASCT自体免疫细胞治疗技术抗原肽库之一。然而众所周知，p53基因是一种重要的抑癌基因，可以阻止肿瘤的发生，那么为什么MASCT自体免疫细胞治疗技术却将其列为T细胞抗击肿瘤的靶标？

      健康医生要求首先我们来认识一下p53基因

      人类p53基因定位于17号染色体，全长16-20kb,含有11个外显子，转录2.8kb的mRNA,编码一种分子量为53kDa的蛋白质，因此将其命名为p53基因，是一种核内磷酸化蛋白。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。

      正常(野生型)p53基因的表达

      p53基因编码的p53蛋白由393个氨基酸组成，具有特异的转录激活作用。在DNA损伤时，细胞的主要反应之一便是p53蛋白的增加。p53蛋白主要集中于核仁区，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化调控。正常p53的生物功能好似“基因组卫士（guardian of the genome）”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。如有损伤，p53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，p53蛋白即启动程序性死亡（凋亡）过程诱导细胞自杀，阻止有癌变倾向的突变细胞的生成，从而防止细胞恶变。

      p53突变基因表达

      当p53基因发生突变后，由于空间构想印象到转录活化功能及P53蛋白的磷酸化过程，这不仅失去野生型p53抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具备癌基因的功能。突变的p53蛋白与野生型的p53蛋白相结合，形成的这种寡居蛋白不能结合DNA，阻止DNA的复制，使得一些癌变基因转录失控导致肿瘤发生。

      为什么P53基因可以作为肿瘤抗原，成为T细胞抗击肿瘤的靶标？

      p53基因表达产物p53蛋白由393个氨基酸残基构成，在体内以四聚体的形式存在，p53蛋白主要集中于核仁区，半衰期为20-30分钟。正常情况下，细胞中p53蛋白的含量很低，因其半衰期短，所以很难检测出来，但在生长增值的细胞中，可升高5-100倍以上。肿瘤患者肿瘤组织处于快速增殖状态，p53蛋白半衰期延长，表达量增加，可存在肿瘤细胞表面而被T细胞识别。而科学家们发现在癌症中最为常见的突变基因就是p53，超过50%的肿瘤中都存在着p53和其相关基因的突变和缺失。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。

      总之

      我们将p53列入MASCT自体免疫细胞治疗技术抗原肽库的基础抗原，是因为：1. 超过50%的肿瘤中都存在着p53和其相关基因的突变和缺失2.正常p53基因的表达主要集中于核仁区，半衰期短，含量低，很难检测的到，相反p53突变基因的表达量增加，半衰期延长，p53蛋白可存在肿瘤细胞表面而被T细胞识别。换句话讲，MASCT自体免疫细胞治疗技术对50%存在着p53和其相关基因突变的肿瘤患者起杀瘤作用。

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基因失活后，腺癌变鳞癌
这是一个谈“癌”色变的年代。肺癌堪称癌症“头号杀手”，其五年存活率仅为15%，且发病率和致死率历来一直高居恶性肿瘤榜首。在我国，每年约有40万人死于肺癌；卫生部门公布的第三次死因调查结果显示，肺癌导致的死亡人数在过去三十年中上升了465%。

　　根据病理学分类，肺癌大致可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌；顾名思义，显微镜下观察组织切片会发现前者的细胞个头较小，而后者较大。非小细胞肺癌是肺癌的主要类型（约占肺癌的85%），其中又包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌等不同亚型。虽然都属于非小细胞肺癌，但腺癌和鳞癌具有不同的发病过程和病理学特征，而且对某些药物或治疗手段也有着不同的响应效果。

　　具体到某个特定肺癌患者身上，为了更好地治疗，需要弄明白这个患者是什么肺癌亚型，癌细胞发生了哪些基因突变，有什么药物是专门针对这些突变的，用药后癌细胞会不会又发生变化导致耐药？这些都是研究者关注的热点问题。

　　利用DNA测序技术，科学家们目前已经发现多个参与肺癌发病的驱动基因（Driver Gene）突变,包括KRAS, EGFR, LKB1等。临床上，携带EGFR突变的肺癌患者可以使用小分子化合物或抗体药物进行靶向治疗。遗憾的是，超过20%的非小细胞肺癌患者携带的是LKB1基因的失活型（缺失）突变，而且目前对这类患者尚无针对性的治疗策略。

　　5月1日，季红斌研究组对LKB1基因的最新研究作为封面文章（Cover Story）发表在国际肿瘤学权威学术杂志《癌症细胞（Cancer Cell）》上。封面图就是我们这个研究的隐喻——《西游记》中，被擒的孙悟空在太上老君的炼丹炉中被困49天，但依然大难不死，还练就了火眼金睛。而缺失LKB1的肺腺癌,在高活性氧簇（Reactive Oxygen Species,以下简称ROS）的恶劣环境中依然拥有超强的可塑性，甚至还能变身成鳞癌，与孙猴子的情形何其相似。


当期《Cancer Cell》封面，孙悟空在“高氧”炼丹炉里呆过后，不但没死，还练就了火眼金睛。
图片来源：李福明

　　LKB1：帮细胞在逆境存活的抑癌基因

　　LKB1基因具有两大功能：作为经典的防癌卫士（抑癌基因），它可以抑制细胞增殖和阻止肿瘤发展；当环境压力较大，细胞感到“饥饿”时，它又能使细胞合理控制营养摄取、维持代谢和氧化还原稳态。

　　当LKB1发生缺失突变，肺癌细胞就摆脱了LKB1的束缚，有了快速增殖的能力，然而，LKB1缺失后，癌细胞也随之失去了在营养匮乏的逆境中的适应能力。那么问题来了，缺失LKB1的肺癌细胞如何处理这一矛盾，在逆境中生存下来呢？

　　我们打算先在小鼠身上看看，除去了LKB1基因后，肺癌的发病过程究竟是怎样的。

　　如今，利用基因工程技术，我们可以在实验小鼠的肺泡细胞中改造LKB1或其它基因使其产生肿瘤。出乎意料的是，在不同的肺癌小鼠模型中，我们得到的结果不太一样。在Kras/Lkb1小鼠模型中，敲除LKB1不仅大大加速肿瘤进展，还使小鼠同时产生腺癌、鳞癌和腺鳞癌，而其它模型如Kras或Kras/p53小鼠，却只产生腺癌。

　　肺癌细胞的生存之道：穷则变，变则通

　　我们发现，Kras/Lkb1小鼠之所以会同时产生腺癌、鳞癌和腺鳞癌，其实是LKB1缺失引起了肿瘤可塑性 （Tumor Plasticity），导致腺癌向鳞癌发生转变。我们推测，这种肿瘤可塑性可能是缺失LKB1的肺腺癌细胞适应逆境生存的一种方式。

　　于是，我们借助基因芯片和高效液相色谱串联质谱分析，比较了Kras/Lkb1小鼠肺腺癌细胞和鳞癌细胞中的代谢指标，发现腺癌细胞确含有较高水平的活性氧簇（即ROS）。ROS包括超氧离子和过氧化氢等，它的异常积累会导致DNA受到氧化性损伤、加速细胞衰老甚至肿瘤发展。事实上，降低腺癌中的ROS水平会抑制其向鳞癌的转变。由此可见，ROS的积累给腺癌细胞带来了“危机”，它却像孙猴子一样摇身一变,成了鳞癌，并因此谋取了另一条“活路”。


活性氧簇水平上升促使缺失LKB1的腺癌逐渐转化为鳞癌 图片来源：李福明

　　为什么腺癌细胞会积累更多的ROS？同样跟LKB1基因的缺失有关。正常情况下，细胞可通过戊糖磷酸途径和脂肪酸氧化这两条代谢通路及时清除ROS并维持氧化还原态的平衡；脂肪酸氧化直接受LKB1“领导”：LKB1的缺失可导致其“消极怠工”，至于戊糖磷酸途径的活性在营养匮乏时则会下调。我们发现这两条代谢通路的活性在肺腺癌中显著下降，这就是导致ROS积累的“罪魁祸首”，恢复这两条通路的活性，就可以抑制腺癌转变为鳞癌。

　　寻找耐药肺癌的治疗之道

　　我们的肺癌小鼠模型还有另一个重要应用——开展临床前试验（Preclinical Trials）来评价某些药物或治疗策略的有效性和安全性。

　　我们在Kras/Lkb1小鼠模型中发现，荜茇酰胺（Piperlongumine）和苯乙双胍（Phenformin）这两种药物对缺失LKB1的肺腺癌有一定的疗效，对鳞癌却没有作用。因为这些药物可诱导ROS的积累，ROS又会促使一部分腺癌转变为鳞癌并最终产生耐药性。

　　由此看来，腺癌的“变身术”不仅能使自己度过“ROS危机”，更能逃脱一些药物的杀伤作用。这暗示临床上携带LKB1突变的肺腺癌有可能通过转变为肺鳞癌来逃脱某些药物治疗，这可能是一种全新的耐药方式。试想一下，一种针对肺腺癌的药物刚开始或许还有用，时间一长，当肺腺癌变成肺鳞癌之后，药物就失效了，这时或许就需要及时更换另一种针对肺鳞癌的药物。

　　目前，我们正在继续深入研究，希望早日找到更有效的策略来治疗缺失LKB1的肺癌，给这只大闹天宫的“孙猴子”戴上“紧箍咒”！

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P53基因研究结果综述

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